附錄B

（規(guī)范性附錄）

醫(yī)療廢物消毒處理效果微生物檢測(cè)程序和方法

B.1 醫(yī)療廢物高溫蒸汽消毒處理效果微生物檢測(cè)程序和方法

B.1.1 檢測(cè)材料

采用國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)批準(zhǔn)的生物內(nèi)含式生物指示劑。生物指示劑為嗜熱脂肪桿菌芽孢（B.s tearothermophilus ATCC 7953），含菌量為5×105-×106cfu/片。

B.1.2 檢測(cè)方法

B.1.2.1 處理效果檢測(cè)應(yīng)采用符合《消毒技術(shù)規(guī)范》制作要求的嗜熱脂肪桿菌芽孢生物指示劑，并在其有效保質(zhì)期內(nèi)。

B.1.2.2 將多個(gè)生物指示劑菌管隨同醫(yī)療廢物，放置于殺菌室內(nèi)蒸汽處理效果最難保證的空間位置，或?qū)⒕芊胖迷诎b盒內(nèi)并裹挾進(jìn)醫(yī)療廢物中，在按照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的滅菌參數(shù)下，進(jìn)行消毒處理。

B.1.2.3 消毒處理完畢后，取出指示菌劑，捏碎玻璃管，按照產(chǎn)品規(guī)定的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間進(jìn)行培養(yǎng)（如無(wú)特殊說(shuō)明，培養(yǎng)溫度為56℃，培養(yǎng)時(shí)間為48h），同時(shí)以沒(méi)有經(jīng)歷消毒處理的生物指示劑菌管做對(duì)照，并觀察培養(yǎng)基顏色變化。試驗(yàn)重復(fù)3次。

B.1.3 消毒效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

以經(jīng)過(guò)消毒的陰性菌管與陽(yáng)性對(duì)照菌管的顏色變化相同與否判斷是否到達(dá)消毒效果要求，陰陽(yáng)對(duì)照菌管顏色變化相同或都不發(fā)生變化，說(shuō)明消毒不合格；顏色變化不同，說(shuō)明消毒合格。

B.2 醫(yī)療廢物化學(xué)消毒處理效果微生物檢測(cè)程序和方法

B.2.1 檢測(cè)材料

B.2.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株：枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）。

B.2.1.2 消毒因子：化學(xué)消毒劑。

B.2.1.3 中和劑：根據(jù)不同的化學(xué)消毒劑選擇適宜的中和劑。

B.2.1.4 稀釋液：胰蛋白胨生理鹽水溶液。

B.2.1.5 培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基、胰蛋白胨大豆培養(yǎng)基。

B.2.1.6 染菌載體：管長(zhǎng)為2cm，內(nèi)徑為4mm的輸液管。

B.2.1.7 模擬醫(yī)療廢物的成分大致包括：5％的有機(jī)原料（如漢堡包、肉包子、饅頭）和95%塑料、纖維素和玻璃等。模擬醫(yī)療廢物的總投加重量應(yīng)大于或等于實(shí)際應(yīng)用中的最大負(fù)荷重量。

B.2.1.8 模擬殺菌因子：粉劑化學(xué)消毒劑（如石灰粉）可采用滑石粉；液體化學(xué)消毒劑（如次氯酸鈉、二氧化氯等）可采用去離子水。

B.2.1.9 細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所用器材，參考《消毒技術(shù)規(guī)范》。

B.2.2 檢測(cè)方法

B.2.2.1 枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）的制備按照《消毒技術(shù)規(guī)范》相關(guān)方法制備枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）懸液。

B.2.2.2 染菌樣本的制備方法

a）用胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB)配制成含芽孢懸液濃度為108-1010cfu/mL的TSB芽孢懸液。

b）將輸液管放入裝有芽孢懸液的容器中，攪拌，使其充分接觸并浸泡5min后，將輸液管放在消毒大搪瓷盤(pán)中，置于37℃恒溫箱中烘干，制成染菌載體備用，使每克樣本的回收芽孢數(shù)量在5×105-5×106cfu。

B.2.3 中和劑鑒定試驗(yàn)

按《消毒技術(shù)規(guī)范》中的方法進(jìn)行中和劑鑒定試驗(yàn)。

B.2.4 處理效果檢測(cè)實(shí)驗(yàn)

B.2.4.1 對(duì)照組操作步驟

a）處理過(guò)程：將一定數(shù)量染菌樣本與待消毒的模擬醫(yī)療廢物混合投加到預(yù)先已清潔過(guò)（未受到污染）的醫(yī)療廢物處理設(shè)備中，并按設(shè)備操作說(shuō)明書(shū)的劑量要求和方法，在最大負(fù)荷量（滿(mǎn)載）的情況下，加入模擬殺菌因子作為對(duì)照組進(jìn)行處理。

b）采樣：醫(yī)療廢物處理過(guò)程結(jié)束后，在設(shè)備出口排出的醫(yī)療廢物殘?jiān)惺占欢〝?shù)量的樣品。

從收集樣品中揀出染菌樣本，取1g-2g，以無(wú)菌操作方式，用剪刀剪碎后加到裝有20mL中和劑的離心管中，作用10min，將離心管用手振打200次，并做10倍系列稀釋?zhuān)x取適宜稀釋度，分別吸取1mL，以?xún)A注法接種于兩個(gè)平皿中，做活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)。

B.2.4.2 實(shí)驗(yàn)組操作步驟

在最大負(fù)荷量（滿(mǎn)載）的情況下，將模擬殺菌因子改為化學(xué)消毒劑，其余操作步驟包括采樣過(guò)程均與對(duì)照組操作步驟相同。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組試驗(yàn)均重復(fù)3遍。

B.2.4.3 陰性對(duì)照組操作步驟

試驗(yàn)結(jié)束后，將用過(guò)的同批次中和劑、洗脫液和稀釋液接種培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；另將未用過(guò)的同批次培養(yǎng)基放入恒溫箱進(jìn)行培養(yǎng)，作為陰性對(duì)照。

B.2.5 殺滅對(duì)數(shù)值的計(jì)算方法

每克樣本菌落數(shù)：（A×B×C）/D

A為每平板平均菌落數(shù)；B為稀釋度；C為樣本洗液體積（mL）；D為樣本的重量（g）；殺滅對(duì)數(shù)值（KL）=No－NxNo為對(duì)照組每克樣本菌數(shù)的對(duì)數(shù)值；Nx為實(shí)驗(yàn)組每克樣本菌數(shù)的對(duì)數(shù)值。

B.2.6 消毒效果評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

在3次試驗(yàn)中，對(duì)照組細(xì)菌芽孢數(shù)量應(yīng)在5×105-5×106cfu/g，各次試驗(yàn)的殺滅對(duì)數(shù)值均≥4.00，陰性對(duì)照組均無(wú)菌生長(zhǎng)，可判為消毒合格。

B.3 醫(yī)療廢物微波消毒處理效果微生物檢測(cè)程序和方法

B.3.1 檢測(cè)材料

B.3.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株：枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）或嗜熱脂肪桿菌芽孢（B.stearothermophilus ATCC 7953）。

B.3.1.2 染菌載體：10mm×10mm 布片。

B.3.1.3 微波漏能檢測(cè)儀（檢測(cè)消毒倉(cāng)室微波有無(wú)泄漏）。

B.3.1.4 培養(yǎng)基：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基。

B.3.1.5 洗脫液：胰蛋白胨生理鹽水溶液。

B.3.1.6 細(xì)菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)所用器材：參考《消毒技術(shù)規(guī)范》。

B.3.2 檢測(cè)方法

按照《消毒技術(shù)規(guī)范》相關(guān)方法制備枯草桿菌黑色變種芽孢（B.subtilis var.niger ATCC 9372）和嗜熱脂肪桿菌芽孢（B.stearothermophilus ATCC 7953）菌片。

編輯：趙凡